Thèmes de recherche
L’équipe Vin Alimentation Microbiologie et Stress est spécialisée dans l’étude des micro-organismes de la vigne et du vin et dans la caractérisation des interactions cellules hôte-microbiote.
Thématique 1 : Les micro-organismes de la vigne et du vin
I. Adaptation de la bactérie lactique Oenococcus oeni au milieu vin
La fermentation malolactique (FML) des vins est principalement assurée par la bactérie lactique O. oeni. Outre la modification de l’acidité liée à la décarboxylation de l’acide malique, cette seconde fermentation influence grandement la qualité organoleptique des vins, particulièrement des vins rouges. Les conditions physico-chimiques extrêmes du vin (pH et température faibles) associées à la présence de compétiteurs biologiques (levures et flore bactérienne d’altération) nuit au développement et à la survie de O. oeni et par conséquent au bon déroulement de la FML. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’adaptation de O. oeni au milieu vin et d’optimiser son maintien dans cet environnement extrême pour un meilleur déroulement de la FML.
A. Mode de culture et fermentation malolactique : les biofilms de Oenococcus oeni
(Collaborations : PCAV UMR PAM, Micalis, B2HM, Massy, France ; ISVV, Bordeaux, France)
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Publication :
Bastard A., Coelho C., Briandet R., Canette A., Gougeon R., Alexandre H., Guzzo J., Weidmann S. 2016. Using Oenococcus oeni biofilm to control malolactic fermentation and modulate the organoleptic qualities of wine. Frontiers in Microbiology 7:613.
B. Bases moléculaires de la réponse au stress
1. Interaction de Lo18 avec la membrane cytoplasmique
(Collaborations : ICB, Dijon, France ; IBS, Grenoble; Micalis, B2HM, Massy)
La petite protéine de stress (sHsp) Lo18 est essentielle au maintien de la fluidité membranaire et à la prise en charge des protéines cellulaires endommagées par les stress environnementaux. Lo18 est une protéine dynamique qui adopte des configurations différentes selon les substrats protéiques (oligomères) ou lipidiques (dimère) avec lesquels elle interagit (figure 2A). Elle présente une affinité plus importante pour la membrane dans un état fluide en lien avec la composition en acides gras. La dynamique d’oligomérisation de cette smHsp, ainsi que l’interaction Lo18-membrane ont été caractérisées in situ par microscopie à force atomique (figure 2 B et C).
Figure 2 : A) Modèle de la réponse au stress éthanol chez Oenococcus oeni. B) Dynamique d'oligomérisation observée par HS-AFM de la sHsp Lo18 de pH 9 à pH 5. Images enregistrées à une vitesse de balayage de 4 images/s et pour un balayage de 150 nm x 150 nm. Les flèches indiquent les dimères progressant dans le processus d'oligomérisation. La série d'images met en évidence le processus complet d'oligomérisation effectué en moins de 80s (processus réversible). C) Structure tridimensionnelle de la protéine Lo18 reconstituée à partir des images obtenues en cryo-électromicroscopie à pH 5.
Publication :
Maitre M, Weidmann S, Rieu A, Fenel D, Schoehn G, Ebel C, Coves J, Guzzo J. 2012. The oligomer plasticity of the small heat-shock protein Lo18 from Oenococcus oeni influences its role in both membrane stabilization and protein protection. Biochemical J. 15, 97-104
2. CtsR : chef d’orchestre de la réponse au stress
(Collaboration : Laboratoire Biologie des bactéries pathogènes à Gram-Positif, Institut Pasteur de Paris)
Tandis que chez B. subtilis cinq mécanismes distincts contrôlent l’expression des gènes hsp (heat shock protein), l’analyse comparative du génome de O. oeni montre que ctsR est actuellement le seul gène connu impliqué dans la réponse au stress chez cette bactérie d’intérêt œnologique. Particulièrement caractérisé chez B. subtilis, CtsR est un répresseur transcriptionnel impliqué dans le contrôle de l’expression des gènes de classe III (clpP et opéron clpC). La construction de fusions transcriptionnelles impliquant les régions promotrices des gènes hsp de O. oeni a permis de confirmer la fonction de ce répresseur transcriptionnel chez O. oeni. L’analyse du niveau d’expression de ces fusions menée en système d’expression hétérologue chez B. subtilis a permis de mettre en évidence une régulation CtsR-dépendante de la majeur partie des gènes hsp de O. oeni soulignant la singularité de cette bactérie lactique pour son mode de régulation dans la réponse au stress. L’analyse par comparaison génomique indique que la régulation de CtsR ne répond pas au même modèle que celui décrit chez B. subtilis. Nos recherches d’orientent désormais sur la caractérisation des mécanismes impliqués dans la régulation de l’activité de CtsR chez O. oeni.
Publication : Darsonval et al, Manuscrit en préparation
C. Mise en œuvre d’outils pour l’exploration fonctionnelle des gènes chez O. oeni
(Collaboration : Laboratoire Biologie des bactéries pathogènes à Gram-Positif, Institut Pasteur de Paris)
O. oeni est singulièrement réfractaire aux techniques de manipulation génétique usuellement appliquées chez les bactéries lactiques ce qui limite la caractérisation fonctionnelle des gènes chez cette bactérie. Jusqu’à présent la fonction de ces gènes était étudiée en système d’expression hétérologue. Ainsi le gène cfa dont l’expression est induite en condition de stress a été caractérisé chez E. coli puis chez Lactococcus lactis. La caractérisation biochimique de cette CFA synthase a permis de rendre compte d’une probable spécificité de cette enzyme vis-à-vis des lipides membranaires de O. oeni. Particulièrement long et fastidieux, le développement d’outils génétiques adaptés à cette bactérie a donné lieu à la mise au point d’une technique d’électroporation, utilisant l’éthanol en tant que fluidifiant membranaire. Cette technique nous permet désormais d’introduire des vecteurs plasmidiques chez O. oeni. Sur la base des outils génétiques développés pour Lactobacillus plantarum, un vecteur a été adapté pour son utilisation en tant que vecteur d’expression chez O. oeni. Ce vecteur a donné lieu à l’expression dans la souche O. oeni ATCC BAA
1163 de gènes codant des estérases. L’activité estérase détectée dans les souches recombinantes a permis de juger de la fonctionnalité de ces gènes ainsi que de l’impact de leur produit d’expression sur le profil aromatique des vins au cours de la FML. Sur la base de ce nouvel outil, l’expression d’ARN anti-sens a été mise en oeuvre afin de moduler in vivo l’expression de gènes cible. Appliquée au gène hsp18, cette technologie knock-down a permis de rendre compte in vivo du rôle de Lo18 dans la tolérance de cette bactérie à un environnement acide et à un stress thermique.
Ces avancées technologiques dans la maitrise de la manipulation du génome de O. oeni nous permet désormais de poursuivre in vivo la caractérisation de la réponse au stress chez O. oeni et tout particulièrement des mécanismes impliqués dans la régulation de l’activité de CtsR.
Publications :
Darsonval M, Msadek T, Alexandre H, Grandvalet C. 2015. The Antisense RNA Approach: a New Application for In Vivo Investigation of the Stress Response of Oenococcus oeni, a Wine-Associated Lactic Acid Bacterium. Appl Environ Microbiol. 9;82(1):18-26
Darsonval M., Alexandre H., Grandvalet C. 2016. Genetically engineered Oenococcus oeni strain to highlight the impact of estA2 and estA7 esterase genes on wine ester profile. Food Microbiology 21-8.
II. Ecologie microbienne
A. Impact des facteurs anthropique sur les flores de raisin et de caves
(Collaborations : Institut für Mikrobiologie und Biochemie Zentrum Analytische Chemie und Mikrobiologie, Hochschule Geisenheim University, Geisenheim, Germany; Department of Biology-Genetics University of Bari, Italie ; Equipe PCAV, UMR PAM, Dijon).
Nous nous intéressons aux effets de différentes activités anthropiques (vignoble, cuverie) sur les populations fongiques du raisin au vin. Au vignoble, l'impact de la protection phytosanitaire a été mis en évidence : une biodiversité fongique plus faible a été mesurée sur 3 millésimes consécutifs pour la modalité biologique comparée à la modalité conventionnelle (figure 3). En cuverie, les populations fongiques sont fortement remaniées après pressurage/clarification, mais les différences observées au vignoble subsistent. Par une analyse chimique non-ciblée des vins obtenus, des signatures de diversité chimique et microbiologique liées au mode de protection au vignoble ont été mises en évidence. Nous démontrons également pour la première fois, que la baie de raisin constitue une source limitée pour les levures non-Saccharomyces (NS) alors que la cuverie semble constituer une source majoritaire. De plus, la persistance et la réimplantation des levures NS dans le moût l’année suivante ont été démontrées. Ces travaux nous ont amené à développer une nouvelle étude sur la compréhension des dynamiques de populations levuriennes indigènes dans une nouvelle cuverie afin de comprendre leur implantation et leur persistance au cours des millésimes suivants.
Figure 3 : Répartition de la flore fongique sur baies de raisins issus de vignoble conduit en conventionnel en biologique ou en mode réduction de produits phytosanitaire. Les populations sont identifiées par pyroséquençage.
Publication :
Grangeteau, C., Roullier‑Gall, C, Rousseaux, S, Gougeon, R, Schmitt‑Kopplin, P, Alexandre, H and Guilloux‑Benatier. M 2016. Wine microbiology is driven by vineyard and winery anthropogenic factors. Microb. Biotechnol. 0–34.
B. Interactions entre micro-organismes ou comment maîtriser les fermentations en cultures mixtes
(Collaborations : Equipe PCAV, UMR PAM, Dijon, Research Unit Analytical BioGeoChemistry, Department of Environmental Sciences, Helmholtz Zentrum München, Ingolstädter Landstr.1, Neuherberg, Germany]
Pendant les processus fermentaires, les micro-organismes interagissent les uns avec les autres. Ces interactions sont le fruit de mécanismes moléculaires et physiologiques et elles subsistent que ce soit au cours de fermentations naturelles ou industrielles. Dans le dernier cas, des levains complexes ont été développés, cependant leur utilisation est limitée par l’absence de connaissances sur les mécanismes d’interactions survenant au cours de ces fermentations mixtes. Une meilleure connaissance de ces mécanismes d’interactions permettra de mieux contrôler les fermentations en cultures mixtes et de mieux comprendre la dynamique des populations en fermentation indigène. Ce sont là les principaux objectifs des études conduites au sein de VALMIS.
L’équipe a montré précédemment, par une approche métabolomique, qu’un microorganisme pouvait moduler le métabolisme d’un autre microorganisme. Le futur enjeu consiste à comprendre comment une espèce peut modifier le métabolisme d’une autre espèce. Afin de caractériser la nature des interactions, la dynamique des populations en mélange sera suivie par analyse multiparamétrique. L’existence de mécanisme de communication cellulaire ou de cell-contact sera recherchée et l’impact des paramètres environnementaux sur les interactions sera étudié. A cet effet le laboratoire développe une expertise en analyse multiparamétrique des levures par cytométrie de flux.
Publication :
Liu Y., Forcisi S., Harir M., Deleris-Bou M., Krieger-Weber S., Lucio M., Longin C., Degueurce C., Gougeon R. D., Schmitt-Kopplin P. and Alexandre H. 2016. New molecular evidence of the wine yeast-bacteria interaction unraveled by non-targeted exometabolomic profiling. Metabolomics 17:114
C. Les levures non-saccharomyces : intérêt et impact sur le métabolisme de S. cerevisiae
L’intérêt biotechnologique des levures et en particulier des levures non-Saccharomyces (NS) est un axe de recherche qui se développe fortement au sein de l’équipe VAlMiS. Les levures NS, autrefois décrites comme pouvant être indésirables, sont maintenant étudiées pour leurs potentiels œnologiques et organoleptiques. Plusieurs études sont actuellement en cours pour comprendre l’implication des levures NS au cours de la vinification. Les principaux objectifs sont d’évaluer leur impact sur la biodiversité et la complexité aromatique.
Le premier axe d’étude porte sur l’utilisation des levures NS dans la réduction d’intrants exogènes chimiques tels que le SO2. La compréhension et l’évaluation de l’impact des levures NS s’avèrent donc essentielles pour maitriser leur application dans la bio-protection des moûts de raisin et ainsi réduire les concentrations de sulfites d’un point de vue antiseptique et antioxydant.
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| Figure 4 : Isolement de levures non-Saccharomyces issues d'un moût Aligoté (Simonin S) |
Outre les études portant sur l’application des levures NS en bio-protection comme alternative à l’utilisation des sulfites, un second axe d’étude s’intéresse à l’utilisation des levures NS dans l’objectif de diminuer la concentration en alcool dans les vins. Effectivement, depuis quelques années, suite au réchauffement climatique la concentration en sucre dans les moûts est de plus en plus élevée, ce qui a pour conséquence de produire des vins fortement alcoolisés. Des solutions sont déjà existantes mais leur utilisation peut impacter la qualité organoleptique du vin. C’est pourquoi l’utilisation des levures NS en inoculation séquentielle est envisagée. Ces levures ne possédant pas les mêmes rendements en éthanol, ainsi elles peuvent permettre d’envisager une réduction de près de 2% de la concentration finale en éthanol. Dans l’optique d’application de nouveaux procédés technologiques de maitrise des procédés impliquant des micro-organismes, les études en cours s’intéressent à mieux comprendre les mécanismes mis en jeux chez ces levures et l’impact de leur présence sur le métabolisme de Saccharomyces cerevisiae.
En appui aux deux axes précédents, un troisième axe d’étude porte sur l’étude des interactions entre la levure Saccharomyces cerevisiae et des NS sélectionnées pour leur intérêt organoleptique dans le vin fini. En effet, des études au laboratoire ont montré que les NS sont capables de produire des composés aromatiques recherchés dans le vin, mais qu’elles perdent cette capacité de production en présence de S. cerevisiae ou bien présentent une mortalité précoce en début de FA en raison d’interactions. Les mécanismes mis en jeu ainsi que la nature des interactions pouvant avoir lieu sont peu décrits et peu connus. L’objectif est de déterminer et de caractériser ces interactions entre les espèces de levures au cours de la FA afin d’apporter des connaissances transférables pour la filière viti-vinicole.
III. Brettanomyces : mode de survie en vin et en cave
(Collaborations : Microflora ; Inter-Rhône ; BIVB)
La levure Brettanomyces (figure 5) est considérée comme une levure d’altération dans les vins. En effet, elle est responsable de la production de phénols volatils qui altèrent le vin. C’est pourquoi la filière cherche les moyens de détecter spécifiquement cette levure et de comprendre son mode de résistance aux sulfites.
Nous avons étudié, pour la première fois, le lien entre la quantité de SO2 et le niveau de population de la levure dans les vins. Nous avons démontré pour une même dose de SO2 que plus la population est importante et moins les sulfites sont efficaces. Nous avons détecté des Brettanomyces en état viable mais non cultivable dans les vins, mais ces cellules ne produisent pas de 4-éthylphénol. Par contre, elles peuvent redevenir cultivables et altérer le vin lorsque la concentration en sulfite baisse au cours du temps. Ces résultats montrent l’intérêt d’une quantification précise de Brettanomyces.
Afin de répondre aux questionnements de la filière sur la présence de Brettanomyces au cours de l'élevage, nous étudions l'évolution au cours du temps des flores présentes en cave (bactéries, levures totales, Brettanomyces). L’étude portera sur 3 caves (avec ou non des problèmes de contaminations par Brettanomyces, utilisant ou non des starters levuriens, et ayant une hygiène plus ou moins rigoureuse). Ceci permettra de mieux connaitre la composition de la flore de la cave et son évolution au cours du temps. Un suivi jusqu’au niveau de la souche sera effectuée pour Brettanomyces afin de voir si les caves à problème ont plus de Brettanomyces et/ou des souches plus résistantes (notamment au SO2) que les caves sans problème.
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Figure 5 : Photo de microscopie électronique à balayage de cellules de Brettanomyces (Serpaggi, 2011). |
Publication :
Longin C., Degueurce C., Julliat F., Guilloux-Benatier M., Rousseaux S., Alexandre H. 2016. Efficiency of population-dependent sulfite against Brettanomyces bruxellensis in red wine. Food research international. 89(1) :620-630
Thématique 2 : Interactions cellules hôtes-microbiote
I. Effet bénéfique de la culture en biofilm sur la formulation, la conservation et les fonctionnalités des probiotiques
(Collaborations : Micalis, B2HM, Massy, France et Equipe PCAV, UMR PAM, Dijon)
Le développement des bactéries probiotiques sous forme de biofilm est une spécificité de notre équipe (figure 6). Nous avons démontré que le phénotype biofilm favorise l’implantation des bactéries dans le tube digestif et leur action bénéfique. Nous avons développé des biofilms de bactéries probiotiques du genre Lactobacillus sous une forme comestible. L’objectif est de formuler un film comestible à base de polyoside présentant des propriétés permettant l’adhérence de bactéries probiotiques et leur développement en biofilm. Ce travail vise à produire les probiotiques sous une forme : (i) résistant mieux aux conditions stressantes du tractus digestif, (ii) capable de s’implanter dans l’intestin et (iii) optimisée du point de vue de la fonctionnalité.
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| Figure 6 : Développement en biofilm de Lactobacillus casei P334 révélé au Cyto9 et observée par microscopie confocale. |
II. Dialogue moléculaire entre micro-organismes et cellules hôtes
A. Modulation de processus clés de l’immunité innée et adaptative : Processus d’autophagie
(Collaboration : Micalis, Probihôte, Jouy-en-Josas, France)
Cette thématique vise à développer des microorganismes probiotiques innovants, naturels ou génétiquement modifiés, pouvant contribuer à l’homéostasie intestinale, en particulier en stimulant le processus d’autophagie. L’autophagie est un processus catabolique intracellulaire essentiel à la survie de chaque cellule eucaryote (pour plus d’informations : http://cfatg.org/outils/pedagogiques/). Si une stimulation de l’autophagie ou le maintien de sa fonctionnalité est associée à un bénéfice santé et à une espérance de vie accrue, à l’inverse, des altérations de ce processus sont associées au vieillissement ainsi qu’à de nombreuses pathologies (maladies inflammatoires chroniques intestinales, diabète, etc…).
A ce jour, très peu de données existent sur la régulation du processus autophagique par les microorganismes commensaux du microbiote intestinal ou des microorganismes probiotiques. Notre thématique de recherche a un double objectif : (1) comprendre l’interaction de bactéries commensales et probiotiques, de levures ou du microbiote dans sa globalité, avec le processus d’autophagie au niveau intestinal que ce soit
en condition basale (homéostasie) ou lors de situations physiopathologiques et (2) utiliser des bactéries probiotiques naturelles ou génétiquement modifiées pour stimuler l’autophagie (figure 7) et ainsi renforcer l’homéostasie intestinale. Nous caractérisons les effets de ces microorganismes sur le processus d’autophagie in vitro sur des lignées de cellules épithéliales intestinales et in vivo chez la souris (germ free ou conventionnelles) et le poisson zèbre.
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Figure 7 : Stimulation du processus d’autophagie dans des cellules humaines par une souche de Lactobacillus casei (L. casei). L’activation du processus est suivie par immunofluorescence (panel de gauche) grâce à un immuno-marquage de la protéine LC3. Une augmentation du nombre de points (dots) de LC3 par cellule traduit l’activation de l’autophagie Publication : Al Azzaz et al. Manuscrit en préparation |
B. Rôle de l’HSP GroEL dans l’interaction et la modulation de la réponse immunitaire par Lactobacillus casei
(Collaborations : Micalis, B2HM, Massy, France ; LNC, Dijon, France ; CSIC, Valencia, Spain)
Le pouvoir modulateur de biofilms de bactéries probiotiques a été caractérisé particulièrement sur l’immunité intestinale innée. Des résultats publiés par notre laboratoire ont démontré que le développement de souches du genre Lactobacillus sous forme de biofilm augmente non seulement ses propriétés anti-inflammatoires mais également sa
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Figure 8 : Colonisation de l’épithélium intestinal de larves de poisson-zèbre par Lactobacillus casei observée par microscopie électronique à transmission. |
capacité à résister à des stress physicochimiques mimant le tractus gastro-intestinal (figure 8). Ces résultats ont été obtenus in vitro sur des lignées immunitaires humaines et in vivo dans le modèle poisson zèbre. Les motifs moléculaires responsables de cet effet anti-inflammatoire ont été identifiés comme associés à la paroi et également relargués dans le surnageant. Nous avons identifié le rôle essentiel de la protéine GroEL dans ce phénomène d’atténuation de la réponse immunitaire in vitro. Cette protéine de la famille des HSP (Heat Shock Protein) est présente en quantité supérieure dans les surnageants de culture de biofilm.
Publications :
Aoudia N, Rieu A, Briandet R, Deschamps J, Chluba J, Jego G, Garrido C, Guzzo J. 2016. Biofilms of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum: Effect on stress responses, antagonistic effects on pathogen growth and immunomodulatory properties.Food Microbiology. 53(Pt A):51-9
C. Mécanismes cellulaires, moléculaires et immunologiques associés à la colonisation digestive par Candida albicans – rôle de facteurs de stress sur ces mécanismes
(Collaborations : CNRS, RIDI UPR 9022, Strasbourg, France ; Institut Pasteur, Unité Biologie et Pathogénicité Fongiques, INRA, USC 2019, Paris, France ; Department of Microbial Pathogenicity Mechanisms, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology-Hans Knoell Institute, Jena, Germany)
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Figure 9 : Image réalisée en microscopie à balayage, montrant l’interaction d’une forme filamenteuse de Candida albicans avec des cellules digestives de la lignée Caco-2. |
Candida albicans (C. albicans) est un micro-organisme eucaryote appartenant à la flore commensale intestinale (i.e. le microbiote), buccale et vaginale de l’homme sain (figure 9). Ce commensalisme résulte d’un équilibre entre la levure et les systèmes de défense de l’hôte. La rupture de cet équilibre chez un patient fragilisé (sujet infecté par le VIH, neutropénique, cancéreux, transplanté ou séjournant en service de réanimation) aura pour conséquence une colonisation intense des muqueuses favorisant un envahissement des cellules épithéliales, la translocation à travers la barrière épithéliale digestive et la dissémination hématogène de la levure. Ce modèle d’étude microbien est très original en ce sens que la nature de l’environnement digestif rencontré chez l’homme va conditionner son existence à l’état commensal ou pathogène. Nos travaux ont pour objectifs de préciser les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’interaction de C. albicans à la muqueuse digestive dans des modèles d’étude in vitro et in vivo. La caractérisation des molécules exprimées par la levure sous ses différentes formes morphologiques (i.e. planctonique ou biofilm) et contribuant au dialogue moléculaire avec la cellule hôte y est abordée
Publications :
Lee KZ, Lestradet M, Socha C, Schirmeier S, Schmitz A, Spenlé C, Lefebvre O, Keime C, Yamba WM, Bou Aoun R, Liegeois S, Schwab Y, Simon-Assmann P, Dalle F, Ferrandon D. 2016. Enterocyte Purge and Rapid Recovery Is a Resilience Reaction of the Gut Epithelium to Pore-Forming Toxin Attack. Cell Host Microbe. 14;20(6):716-730
Goyer M, Loiselet A, Bon F, L'Ollivier C, Laue M, Holland G, Bonnin A, Dalle F. 2016. Intestinal Cell Tight Junctions Limit Invasion of Candida albicans through Active Penetration and Endocytosis in the Early Stages of the Interaction of the Fungus with the Intestinal Barrier. PLoS One. 2;11(3):e0149159
Albac S, Schmitz A, Lopez-Alayon C, d'Enfert C, Sautour M, Ducreux A, Labruère-Chazal C, Laue M, Holland G, Bonnin A, Dalle F. 2016. Candida albicans is able to use M cells as a portal of entry across the intestinal barrier in vitro. Cell Microbiol. 2016 Feb;18(2):195-210y
